Místnost: L039
Kontaktní osoba: Nataliia Iakovenko
V laboratoři je umístěné zařízení pro studium molekulárních aspektů etologie živočichů. Laboratoř slouží především pro analýzu nukleových kyselin, proteinů a steroidních hormonů jako „stavebních kamenů“ fyziologických systémů, které určují reakce zvířat na prostředí. První fází takové analýzy je příprava primárních vzorků, pro které je nutné rozdrtit a rozpustit živočišné tkáně a následně přečistit a separovat organické molekuly, u kterých bude provedena kvalitativní a kvantitativní analýza. Dávkování vzorků se provádí pipetováním roztoků a suspenzí a přidáním odměřeného množství rozpouštědel a pufrů. To se provádí pomocí automatických odměrných pipet ve sterilním prostředí digestoře.
Drcení organických tkání s destrukcí buněčných membrán se provádí ultrazvukem v sonikátoru.
Separace látek v roztocích se provádí pomocí centrifug, kde se pod vlivem odstředivé síly usazují těžké částice na dně a část molekul zůstává v roztoku.
Inkubace roztoků při teplotě nad nebo pod pokojovou se provádí ve termomixeru nebo pomocí magnetické míchačky s ohřevem. Inkubace při pokojové teplotě, která vyžaduje neustálou rovnoměrnou distribuci látky ve velkých objemech roztoku, se provádí na orbitální třepačce.
Před sekvenováním DNA je nutné ji amplifikovat, tzn. provést mnohonásobnou syntézu pomocí enzymu Taq-polymerázy, který funguje při teplotě kolem 72°C. K tomu se používá PCR cycler – zařízení, ve kterém si můžete naprogramovat požadovaný cyklus ohřev-chlazení a v automatickém režimu ho dle potřeby opakovat. PCR (Polymerase Chain Reaction) je zkratka pro tuto enzymatickou reakci, v jejímž důsledku získáme miliony kopií genu, který potřebujeme. Amplifikovanou DNA v roztoku pak po kontrole pomoci horizontální gelové elektroforézy a čistění odešleme k sekvenování.
Gelová elektroforéza se používá nejen pro kontrolu výsledků PCR. Vertikální gelovou elektroforézu používáme pro rozdělení proteinů podle jejich molekulární hmotnosti v elektrickém proudu s dalším zpracováním gelu metodou Western Blot. Blotting (blotování) je převedení separovaných proteinů ve stejným přístroji pro vertikální elektroforézu z gelu na nitrocelulosovou nebo PVDF (polyvinylidene difluoride) membránu. Proteiny jsou pak zachycené (blokované) na membráně na orbitální třepačce. Konkrétní druh proteinu zviditelníme pomoci specifických protilátek proti tomuto proteinu (primární protilátky) a dalších (sekundární protilátky). Detekce proteinu provádíme pomoci skenovaní membrány na přístroji LI-COR C-Digit.
V laboratoři metodou ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) nebo taky EIA (Enzyme Immunoassay) kvantifikujeme steroidní hormony jako indikátory stresu u divokých a domácích savců. Principem této metody je imunoenzymatické reakce pro detekci přítomnosti ligandu (studovaného substrátu) v kapalném vzorku pomocí protilátek namířených proti tomuto ligandu. Množství barevného produktu takové reakce da se změřit spektrofotometricky, jelikož intenzita zabarvení koreluje s koncentrací detekovaného substrátu. Pro měření barevné intenzity roztoků se používá fotometrická čtečka mikrotitračních destiček Life Real, která může detekovat světlo o délce od 340 až 820 nm.
Měření koncentrace látek a buněčné hustoty v kyvetách, včetně určování koncentrace nukleových kyselin, proteinů aj. provádíme pomoci kompaktního spektrofotometru WAP Biowave, a to ve velmi malých objemech (od 1 µl). Toto zařízení povoluje nejen měření, ale taky konstrukce kalibračních křivek pro určovaní koncentrace neznámých roztoků.
V laboratoří je také k dispozici inverzní fluorescenční mikroskop, pomocí kterého lze sledovat procesy v laboratorních kulturách mikroskopických půdních živočichů, rovněž i v kulturách různých tkaní. Například buněčná jádra obarvená DAPI pro zvýraznění DNA lze pozorovat a fotografovat pomoci fluorescenční jednotky přímo v buněčných kulturách.
